六安市

⑩灭活乳酸菌不存在耐药性基因转移、菌体位移和噬菌体感染等问题，使用更加安全。

1.3动物5只SPF级健康雄性SD大鼠，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，生产许可证号SCXK(沪)2013-0016，由浙江中医药大学动物实验中心代为饲养，使许可证号SYXK(浙)2013-0184，条件为温度(221)℃，相对湿度50%～60%，12 h光照，通风频率15～20次/h。2.2.3靶标GO富集分析和KEGG通路富集分析本研究通过David 6.7数据库，对成分-疾病交集靶点蛋白进行GO富集分析、KEGG通路富集分析，其中GO富集分析包括生物过程(biological process)、分子功能(molecularfunction)和细胞组分(cellular component)3个部分，Select Identifier设置为Official GeneSymbol，List Type设置为Gene List，限定物种为人，并用FDＲ错误控制法对P值作检验校正，最终以P＜0.05作为条件进行筛选，筛选出具有显著差异的代谢通路。

蟾毒灵(批号111981-201501，纯度99.2%)、熊去氧胆酸(批号110755-201704，纯度99.4%)、脂蟾毒配基(批号110718-201809，纯度98%)购自中国食品药品检定研究院;远华蟾毒精(批号PS010798，纯度98%)、去乙酰华蟾毒精(批号PS010804，纯度98%)购自成都普思生物科技股份有限公司;沙蟾毒精(批号5283，纯度98%)、甘氨胆酸(批号6723，纯度98%)购自上海诗丹德标准技术服务有限公司;牛磺胆酸(批号PST190801-061，纯度98%)购自成都乐美天医药科技有限公司。然后，使用AutoTools对蛋白进行加氢去除水分子预处理，AutoGrid进行能量格点计算，AutodockVina进行小分子与蛋白对接，对每个对接进行结合能(affinity)评分，PyMoL作活性分子和蛋白的互相作用图。2.2.4入血成分与核心靶点的分子对接对上述麝香通心滴丸的入血成分与核心靶基因进行分子对接，首先通过PubChem数据库得到各分子的化学结构式。利用PharmMapper服务器、GeneCards数据库预测和筛选麝香通心滴丸入血成分治疗冠心病的作用靶点，String数据库绘制蛋白相互作用网络，Cytoscape软件构建成分-疾病-靶点网络图，借助David数据库对靶点进行GO分析和KEGG通路分析，使用Autodock Vina软件对入血成分和核心靶点进行分子对接。2.1.3血清样本处理分别精密吸取200L空白血清和含药血清(将2.1.2项下4个时间点含药血清各吸取50L混匀)于1.5 mL EP管内，加入5倍量甲醇涡旋5 min，离心(4℃、10 000 r/min)10 min，上清液于常温下氮气吹干，100L甲醇复溶，涡旋5 min，离心(4℃、10 000 r/min)5 min，取上清液供MS分析。

2方法2.1麝香通心滴丸入血成分分析2.1.1麝香通心滴丸混悬液制备取适量麝香通心滴丸粉研磨成粉末，加入适量0.5%羧甲基纤维素钠溶液，调整质量浓度为0.4 g/mL，即得，摇匀备用。血清药物化学这一理论最先由德国科学家格哈德多马克所提出，后来我国科学家王喜军教授提出符合中医药理论的中药血清药物化学。扩增条件为 94 ℃预变性5min，94 ℃变性45s，55℃退火30s，72 ℃延伸45 ，35个循环。

1.7 标准曲线建立将阳性重组质粒 DNA 进行 10 倍梯度稀释，使用引物 QF/QR 进行荧光定量 PCR 扩增。2 结果与分析2.1 引物特异性验证应用引物 A5/A9 和 C3/C8 对马铃薯粉痂病菌和其它 11 株非靶标病原真菌基因组 DNA进行常规 PCR 扩增，结果显示仅马铃薯粉痂病菌 DNA 扩增出 281 和 391 bp 的目的条带，而其它供试菌株 DNA 和清水对照未扩增出条带（图 2）。荧光 PCR 反应条件为 95℃预变性 15 min，95℃变性 10 s，60℃退火 32 s，40 个循环。声明：本文所用图片、文字来源《植物病理学报》，版权归原作者所有。

2.2 灵敏度检测利用引物 QF/QR 对不同浓度质粒 DNA 进行常规 PCR 和荧光定量 PCR 扩增，结果表明常规 PCR 灵敏度为 1.38104 fgL-1，荧光定量 PCR 灵敏度为 13.8 fgL-1，是常规 PCR检测灵敏度的 1000 倍（图 4）。质粒拷贝数=[质粒浓度（ngL-1）质粒体积（L）6.021023]/[（载体长度 bp+片段长度 bp）660 gmol-1]1.6 灵敏度检测使用NanoDrop 2000 紫外分光光度计，测定马铃薯粉痂病菌质粒 DNA 浓度，再以 10倍梯度稀释，分别进行普通 PCR 和实时荧光定量 PCR 扩增，根据有无扩增条带及荧光信号值大小，检测其灵敏度

声明：本文所用图片、文字来源《植物病理学报》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系相关链接：马铃薯，基因，荧光。我国内蒙古、广东、贵州、江西、浙江、云南、吉林、甘肃、福建等地均有马铃薯粉痂病的发生，国外许多国家和地区，如以色列、美国、巴基斯坦、哥斯达黎加、韩国、意大利等均有报道。马铃薯粉痂病（Potato powdery scab）是由粉痂菌（Spongospora subterranea f. sp.subterrane）引起的真菌性病害，主要危害根部和块茎，也可使茎染病。

马铃薯粉痂病能使马铃薯产量减少10%～20%，重者可达到 50%。粉痂菌以休眠孢子囊球随种薯或病残体越冬。1 材料与方法1.1 供试菌株试验所用的粉痂菌（S. subterranea）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、葫芦科刺盘孢菌（Colletotrichum lagenarium）、尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）、大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、茄匍柄霉菌（Stemphylium solani）、疫霉菌（Phytophthora infestans）、多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）、细极链格孢菌（Alternariatenuissima）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、疮痂链霉菌（Streptomyces scabies）均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所分离保存（表 1）。和一对实时荧光定量 PCR 的特异性引物 QF: 5'-GCAACTAAATAAAATTTAATGCTAAAAGTG-3'，QR:5'-TTTGTACGCTAAGTTCGATAGGAG-3'，扩增产物大小为 104 bp（图 1）。

近年来，由于 PCR 技术更加快速、准确、便捷而被广泛应用于病原菌的检测和定量研究。Graff 等根据马铃薯粉痂菌内部转录间隔区设计了一对大小为 61 bp 的特异性引物 SsTQF1/SsTQR1 和一个荧光 Taqman探针 SsTQP1，可以检测和定量悬浮在水中或与粘土混合的休眠孢子堆。

由于粉痂菌不能人工培养，国内对马铃薯粉痂菌检测的研究较少，其防治药剂效果也较差，因此，针对马铃薯粉痂菌，亟需建立快速、灵敏、准确性高的检测方法，为该病害的早期监测和预防提供重要依据。已报道的土壤带菌量的检测方法有诱饵法、ELISA 法和 PCR 检测。

Nian 等通过建立实时荧光定量 PCR 体系从而快速准确鉴定了小麦黑穗菌（Tilletia controversa Khn），应用于小麦矮腥黑穗病的早期诊断。混有休眠孢子囊的菌土和田间土壤总 DNA 提取采用 TIANamp Soil DNA Kit 土壤基因组 DNA 提取试剂盒提取土壤总 DNA。Hui 等以番茄幼苗作为诱饵，检测到马铃薯重茬 0～10 cm 土壤中的马铃薯粉痂病菌。Guo 等[21]通过筛选不同疮痂菌的通用探针，建立了马铃薯疮痂菌的快速 PCR 检测方法，实现了对病组织和土壤样品的快速检测。本研究通过筛选特异性好、稳定性高的粉痂菌特异性引物，建立马铃薯粉痂病快速检测体系，以期为马铃薯粉痂病的早期预警提供技术支持。1.2 DNA 提取马铃薯粉痂病斑或培养基平板上培养一周的菌丝体，采用植物基因组 DNA 提取试剂盒提取植物基因组或病原菌基因组 DNA。

针对在生产中马铃薯粉痂病危害严重，缺乏病原菌快速检测的方法的情况。病薯和土壤中病残体为病害的初侵染源，远距离传播主要依靠种薯，田间传播主要通过浇水、病土、病肥等。

NanoDrop 2000定量 DNA 浓度，保存于-20℃备用。但是番茄幼苗诱饵法只能检测到土壤中粉痂病菌活的游动孢子，无法检测到休眠孢子且检测时间较长、操作繁琐。

1.3 引物设计根据 NCBI GenBank 中已登记的马铃薯粉痂菌及其他非靶标菌的标准菌株基因序列（表2），利用DNAMAN 8.0 软件比对，选取粉痂菌内部转录间隔区和线粒体 DNA 的保守区域，设计了两对应用于普通 PCR 的特异性引物 A5: 5'-ACAACTCTTAACAGTGG-3'，A9: 5'-AATGGTTAGAGACGAATC-3'，C3: 5'-AATCTAGAGCACCCCGTTTTCATTCG-3'，C8: 5'-TGCGCAAACCTTAATACGGGAA-3'，扩增产物大小分别为 281 和 391bp。鉴于目前缺乏对马铃薯粉痂菌快速、准确的检测方法，本研究基于马铃薯粉痂菌内部转录间隔区和线粒体 DNA，分别设计了适用于初步检测的普通PCR 特异性引物和实时荧光定量 PCR 特异性引物，建立了快速、高灵敏性的检测体系。

Qu 等[24]根据马铃薯粉痂菌内部转录设计了大小为 434 bp SSF/SSR 引物，该研究成功地应用于有无粉痂病症状的带菌马铃薯块茎的检测，可以检测到1/g土的孢子球。Liu 等利用棉花黄萎病的病原菌菌丝蛋白作为抗原，制备该病原菌菌丝蛋白的多克隆抗体，建立特异性检测棉花黄萎病菌的间接 ELISA 方法，但由于真菌结构与物质组成复杂,寻找特异性抗原有很大难度。引物均由北京博迈德基因公司合成2.3 标准曲线的建立以不同稀释浓度的质粒DNA为模板，利用引物 QF/QR 进行荧光定量 PCR 扩增，结果表明，荧光 PCR 熔解峰单峰，标准曲线为 y=-3.8939x+35.228，R2=0.9966，该体系线性关系良好（图 5）。

声明：本文所用图片、文字来源《植物病理学报》，版权归原作者所有。挑取阳性克隆，转入含有氨苄青霉素的 LB 液体培养基中，37℃、180 rmin-1振荡培养12 h后，提取重组质粒并进行PCR扩增，扩增产物送至北京博迈德生物公司测序，验证是否正确插入目的片段。

吸取菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素的 LB固体平板上，37℃培养 24 h。1.7 标准曲线建立将阳性重组质粒 DNA 进行 10 倍梯度稀释，使用引物 QF/QR 进行荧光定量 PCR 扩增。

扩增条件为 94 ℃预变性5min，94 ℃变性45s，55℃退火30s，72 ℃延伸45 ，35个循环。标准曲线的横坐标和纵坐标分别设定为质粒浓度对数值和循环阈值，使用 Excel 2010 软件构建马铃薯粉痂菌荧光定量 PCR 标准曲线。

1.4 引物特异性检测引物 A5/A9、C3/C8 对马铃薯粉痂菌基因组DNA及其他 11 个非靶标菌株基因组 DNA进行普通 PCR。质粒拷贝数=[质粒浓度（ngL-1）质粒体积（L）6.021023]/[（载体长度 bp+片段长度 bp）660 gmol-1]1.6 灵敏度检测使用NanoDrop 2000 紫外分光光度计，测定马铃薯粉痂病菌质粒 DNA 浓度，再以 10倍梯度稀释，分别进行普通 PCR 和实时荧光定量 PCR 扩增，根据有无扩增条带及荧光信号值大小，检测其灵敏度。1.5 重组质粒的制备马铃薯粉痂菌特异性引物 QF/QR 的扩增产物经回收纯化后，与 pEASY-T1 载体于 25℃连接，转入大肠杆菌 Trans1-T1 感受态细胞中。应用引物 QF/QR 进行实时荧光定量 PCR 扩增，结果表明该引物仅对马铃薯粉痂病菌有唯一的产物吸收峰（图 3）。

1.8 田间土壤及罹病块茎组织样品检测及验证分别从云南省邵通市、甘肃省定西市和河北省张家口市采集 18份带菌土壤和18 份带菌种薯样品，按照 1.2 中的方法提取植物组织样品总 DNA，进行普通 PCR 和荧光 PCR 检测，计算检出率。用测定质粒 DNA 浓度和纯度，根据摩尔定律，计算单位体积质粒所含的 DNA 拷贝数浓度。

如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系相关链接：土壤，马铃薯，DNA。荧光 PCR 反应体系（20 L）为：2SuperReal PreMix Plus 10L，上下游引物（0.1 molL-1）各 0.5 L，50ROXReference Dye 0.4 L，模板 DNA（10 ngL-1）0.5 L，ddH2O 8.1 L。

普通 PCR 反应体系（50L）为：2Taq PCR Master Mix 25 L，上下游引物（0.1 molL-1）各 0.5L，模板 DNA（10 ngL-1）0.5 L，ddH2O 23.5 L。荧光 PCR 反应条件为 95℃预变性 15 min，95℃变性 10 s，60℃退火 32 s，40 个循环。